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利用大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達重組蛋白PFKFB3

發(fā)表時間:2024-01-17 訪問次數(shù):522

腫瘤細胞代謝的研究是近年腫瘤領(lǐng)域的研究熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)大部分的腫瘤促進因子或抑制因子直接影響腫瘤細胞代謝分子。其中糖酵解分子的表達、活性及調(diào)控對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、消退起著至關(guān)重要的作用。在腫瘤細胞增殖過程中,糖酵解所涉及的分子,包括轉(zhuǎn)運分子、關(guān)鍵酶及限速酶,都成為新的抗腫瘤藥物靶點。相應的以腫瘤細胞代謝為靶向的新藥研發(fā)也成為當今新型抗腫瘤藥物研發(fā)的主要方向之一。
6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2, 6-雙磷酸酶(PFKFB) 分子是目前受明顯關(guān)注的影響腫瘤代謝的一組分子。PFKFB是控制果糖-2, 6-二磷酸(F-2, 6-BP)水平的家族性雙功能酶。這類酶的N端能在F-6-PATP存在的條件下合成F-2, 6-BP。相反的, PFKFB也能在果糖-2, 6-二磷酸酶C端作用下催化上述反應的逆反應F-2, 6-BP水解為F-6-P和無機正磷酸鹽。在葡萄糖的代謝過程中,6-磷酸果糖-1-激酶(PFK-1) 催化F-6-P轉(zhuǎn)變成果糖-1, 6-二磷酸(F-1, 6-BP)是關(guān)鍵的限速步驟。而PFKFB的產(chǎn)物F-2, 6-BPPFK-1最強的激活劑。因此,抑制PFKFB的表達或活性進而降低F-2, 6-BP水平,可顯著抑制PFK1的活性進而抑制細胞糖代謝,最終抑制細胞的增殖。相應地,調(diào)節(jié)PFKFBF-2, 6-BP的水平可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

哺乳動物的PFKFB4種異構(gòu)體其中PFKFB3是目前與腫瘤最相關(guān)的PFKFB靶標。PFKFB3編碼的6-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)激酶活性較其磷酸酶活性高700余倍而由PFKFB1、2、4編碼的PFK2其激酶活性比其磷酸酶活性稍高或兩者活性相當。無論是實驗性的離體及在體腫瘤生長,都需要PFKFB3存在。很多來自人的腫瘤標本中,與其相鄰近的正常細胞相比,腫瘤細胞中PFKFB3的表達明顯增高 ,這些腫瘤包括膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌及卵巢癌等

來自佛山科學技術(shù)學院、廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院、北京大學深圳研究生院的研究人員利用大腸桿菌表達系統(tǒng),通過在感受態(tài)細胞BL21(DE3)中轉(zhuǎn)入PFKFB3原核質(zhì)粒,經(jīng)終濃度為25μg/ml的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導,在16℃培養(yǎng)細菌過夜,表達PFKFB3重組蛋白。冰上超聲破菌,離心收集蛋白,通過鎳 (Ni) 柱親和層析和分子篩純化蛋白,運用焦磷酸-磷酸果糖激酶 (PPi-PFK) 法測定PFKFB3酶活性。

蛋白豐度圖譜結(jié)果顯示,PFKFB3蛋白經(jīng)過Ni柱親和層析和分子篩純化后基本只有1PFKFB3的強吸收峰,純化效果良好。
 
應用考馬斯亮藍法測定PFKFB3蛋白濃度為2~4μg/μl, 成功獲得了較高純度和濃度的PFKFB3重組蛋白。

通過 PPi -PFK 酶活性分析法測得 PFKFB3 的果糖 -6- 磷酸 (F-6-P) 和三磷酸腺苷 (ATP) 位點的米氏常數(shù) (Km) 值分別為 142.5、34.21 μmol/L


這項研究構(gòu)建了PFKFB3的原核表達載體通過大腸桿菌表達后,提取純化PFKFB3蛋白并對其酶性質(zhì)進行了測定PFKFB3結(jié)構(gòu)和功能的進一步研究及抑制劑的篩選提供材料并奠定基礎(chǔ)。

參考文獻:
[1].MAI Wei-qian, ZHENG Min-cheng.Expression, purification and enzyme activity determination of recombination protein PFKFB3.[J].Chin J Mod Drug Appl, Dec 2022, Vol. 16, No. 23
 

 

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