自1975年第一支單克隆抗體誕生以來，越來越多的抗體（如嵌合抗體，人源化抗體，以及全人源抗體）被應(yīng)用于各種包括癌癥、自身免疫、代謝和傳染病的診斷和治療，顯示出不斷擴(kuò)大的應(yīng)用前景。然而，在大多數(shù)情況下，較小尺寸的抗體不穩(wěn)定，導(dǎo)致多聚體（特別是單鏈可變片段，scFv）較低的親和力結(jié)合，以及大規(guī)模生產(chǎn)的挑戰(zhàn)。

The various antibody formats: (A) mAb (monoclonal antibody); (B) Fab (fragment antigen binding); (C) HcAb (camel heavy-chain antibody); (D) VHH or Nb (nanobody). Adapted from Yang X, Xie S, Yang X, et al. Opportunities and Challenges for Antibodies against Intracellular Antigens. Theranostics.

駱駝和鯊魚體內(nèi)天然存在一種缺乏輕鏈的獨(dú)特抗體，稱為可變重鏈域，又稱納米抗體（nanobody，VHH）。該抗體僅包含一個(gè)可變區(qū)，體積?。s15kDa）、親和力高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、組織穿透性強(qiáng)、高效表達(dá)、低毒性和低免疫原性等特點(diǎn)，在生化機(jī)制、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、腫瘤等疾病的診斷和治療等方面有著廣泛的應(yīng)用。

Comparison between traditional IgG antibody and camelid heavy-chain antibody. (A) Traditional IgG antibody has two identical heavy chains, consisting of VH, CH1, CH2, and CH3 domains, and two identical light chains, consisting of VL and CL domains. (B) Camelid heavy-chain antibody contains one VHH and two constant domains (CH2 and CH3). A Nb is the VHH domain of heavy-chain antibody obtained by recombinant gene technology. (C) The difference in amino acid sequence of VH and VHH. The average length of the CDR1 and CDR3 is better in the VHH domain than in the VH domain. The dotted line indicates the additional disulfide bond between CDR1 and CDR3 of the VHH domain. The Numbering of the international ImMunoGeneTics-IMGT information system is pointed out. 

納米抗體和傳統(tǒng)抗體的優(yōu)劣對比

性能	傳統(tǒng)抗體	納米抗體
抗體表達(dá)	在哺乳表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，周期長、成本高	既可在哺乳系統(tǒng)中表達(dá)，又可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，表達(dá)的抗體具有高水溶性、易復(fù)性
抗體穩(wěn)定性	易失活，高溫或極度PH下失效或分解	高穩(wěn)定性，高耐性，90℃處理后依然保持較高的活性
免疫原性	較高	較低
組織穿透力	較低	較高，可穿透血腦屏障
半衰期	較長	較短，血清清除速度快

納米抗體的制備

基于完備的抗體開發(fā)技術(shù)平臺以及高效的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，普健生物提供一站式納米抗體（VHH）制備服務(wù)。納米抗體的獲得主要通過免疫羊駝，由羊駝體內(nèi)自身抗體成熟階段來得到抗體基因，然后通過噬菌體展示篩選技術(shù)來從羊駝抗體庫中篩選得到最適合的抗體序列。納米抗體制備的整個(gè)流程主要包括羊駝免疫、噬菌體文庫構(gòu)建、抗體篩選、抗體表達(dá)及功能驗(yàn)證四個(gè)階段。

 

羊駝免疫

?每只羊駝可以同時(shí)免疫1-5個(gè)抗原，每次免疫總的抗原量保持在1-2mg之間，體積在2mL以下，將抗原和佐劑1：1乳化使其形成均勻混合物，4°保存，共進(jìn)行四輪免疫。

噬菌體文庫構(gòu)建

?抽提羊駝淋巴細(xì)胞中RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA文庫，利用特殊設(shè)計(jì)的引物在cDNA文庫中再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到特異的基因片段。隨后將特異的基因片段拼接重組在噬菌體載體上，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌，最終完成納米抗體基因文庫的構(gòu)建。

抗體篩選

?將靶點(diǎn)抗原或者帶有抗原的物質(zhì)直接/間接的固定在固體載體上，隨后加入噬菌體文庫和抗原相互作用。作用一段時(shí)間后陽性噬菌體會和抗原結(jié)合，用洗滌液洗滌固體載體表面，可以將未結(jié)合或非特異結(jié)合的噬菌體洗去。隨后用強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿破壞固體載體上抗原和陽性噬菌體的結(jié)合，從而得到陽性噬菌體溶液。一般重復(fù)進(jìn)行2-3輪的篩選即可獲得符合開發(fā)要求的納米抗體克隆。

抗體表達(dá)及功能驗(yàn)證

通過噬菌體文庫淘選出的納米抗體克隆菌株進(jìn)行納米抗體片段DNA測序后即可進(jìn)行表達(dá)純化及驗(yàn)證。納米抗體可在大腸桿菌，酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系里進(jìn)行表達(dá)，因其僅含100多個(gè)氨基酸殘基，為驗(yàn)證其是否與抗原結(jié)合，可構(gòu)建質(zhì)粒在大腸桿菌中或酵母菌株中進(jìn)行快速表達(dá)及純化。

 

普健生物擁有包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)在內(nèi)的五種表達(dá)系統(tǒng)，相比傳統(tǒng)納米抗體大多采用原核表達(dá)系統(tǒng)，普健生物提供源自法國先進(jìn)的XtenCHO™高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)，能更好的保證抗體正確修飾與活性。如果您近期有納米抗體定制需求，歡迎點(diǎn)擊文字鏈接或閱讀原文了解更多服務(wù)內(nèi)容，或?qū)崟r(shí)與我們項(xiàng)目專員溝通！服務(wù)咨詢電話：027-87001869

我們的優(yōu)勢

自建養(yǎng)殖基地：每年近百頭成年羊駝?dòng)糜诿庖?，穩(wěn)定提供大量的免疫抗原

庫容大：近千億級別天然庫

淘選周期短：最快在2周內(nèi)可完成針對各類靶點(diǎn)的特異性納米抗體快速篩選

親和力高：抗體親和力可達(dá)10-9M 級別

樣本來源豐富：免疫庫源自百余只不同種類的駝?lì)悩颖?羊駝（Alpaca ）、駱駝（Camel）、美洲駝（Llama），提供更高抗體多樣性

超高品質(zhì)：插入正確率100%，序列正確率97%，隨機(jī)選取200個(gè)克隆測序，均無重復(fù)序列

可構(gòu)建免疫庫，獲得更高親和力VHH序列

 

案例展示

第一輪單克隆ELISA驗(yàn)證

第二輪單克隆ELISA驗(yàn)證

ELISA驗(yàn)證重組納米抗體與抗原結(jié)果

重組納米抗體與抗原親和力測定結(jié)果
 

 

 

 

本章小結(jié)
 

今天我們對納米抗體的介紹先告一段落啦

本期我們介紹了納米抗體的結(jié)構(gòu)、納米抗體的特點(diǎn)、

納米抗體的制備流程、普健生物納米抗體服務(wù)及實(shí)例展示

下期我們將繼續(xù)為您介紹納米抗體在臨床的應(yīng)用

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下期不見不散！

未完待續(xù)……