糖基化修飾在藥物蛋白功能、穩(wěn)定性及血漿半衰期等方面起到重要作用。真核生物中糖基化修飾蛋白在維持蛋白穩(wěn)定、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)控、細胞間的互作、細菌-宿主識別互作等過程中發(fā)揮著重要功能。

N-糖基化修飾是蛋白糖修飾的主要方式之一，寡糖通過與新生肽鏈中特定天冬酰胺的酰胺氮連接。在原核生物中也廣泛存在寡糖合成途徑與 N-糖基化修飾蛋白質(zhì)機制，形成病原菌外膜上的脂寡糖。脂寡糖在病原菌黏附和宿主細胞侵入、逃避宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用。

大腸埃希菌是人體不可缺少單細胞生物。大腸埃希菌，俗名大腸桿菌（革蘭氏陰性短桿菌），周身鞭毛，能運動，無芽。是人和動物腸道中的正常棲居菌。

2002 年，瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院Wacker 等研究人員首次將空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni) N-糖基化基因簇( pgl) 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，成功地在大腸桿菌工程菌株中N-糖基化修飾外源蛋白質(zhì)，開創(chuàng)了利用大腸桿菌 N-糖基化修飾重組蛋白新紀元。近 20 年間，人們利用不同來源的糖基化轉(zhuǎn)移酶、寡糖轉(zhuǎn)移酶，在大腸桿菌中開展類人源和人源化 N-糖基化重組蛋白、病原菌寡糖的糖疫苗制備研究。

利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備N-糖基化重組蛋白的機制

天然原核生物 N-糖基化修飾系統(tǒng)主要由4個必要元件組成:糖基化識別序列、糖基轉(zhuǎn)移酶

(glycosyl transferase，GT) 、糖苷酶、糖底物供體，它們分別負責(zé)接受、添加、修剪和提供底物以合成寡糖，并進一步通過依賴寡糖轉(zhuǎn)移酶( oligosaccharyl transferase，OST) /非依賴 OST的途徑將寡糖轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。將以上機制轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中，實現(xiàn) N-糖基化重組蛋白，可重塑合成寡糖鏈及重組蛋白修飾，將在糖疫苗生產(chǎn)、糖基化修飾藥物蛋白等方面具有巨大應(yīng)用潛力。

Schematic diagram of the main mechanism of N-glycosylated recombinant protein production via Escherichia coli

A: OST-dependent N-glycosylation system; B: OST-independent N-glycosylation system

應(yīng)用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備N-糖基化重組蛋白

利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)糖基化基因工程抗體等重組蛋白及糖疫苗是目前熱點研究方向。自2012 年Aebi課題組首次利用大腸桿菌實現(xiàn)類人源化糖鏈Man3GlcNAc2核心五糖 N-糖基化修飾重組蛋白后，利用多種原核生物進行糖基化修飾的技術(shù)一直在不斷探索中，其技術(shù)核心是將其他原核生物來源的寡糖轉(zhuǎn)移酶（識別并將寡糖轉(zhuǎn)移到重組蛋白上的糖基化識別序列上）和多種糖基轉(zhuǎn)移酶（非模板驅(qū)動合成寡糖）在大腸桿菌中共表達，完成寡糖合成及 N-糖基化定點修飾蛋白基本過程。

近幾年研究結(jié)果表明該系統(tǒng)可以實現(xiàn)定點（識別特異氨基酸序列）、均質(zhì)性（糖鏈微觀均質(zhì)、糖蛋白宏觀均質(zhì)）修飾重組蛋白，這是真核系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)勢。真核細胞合成的聚糖性質(zhì)較其他合成途徑而言與人的更為相似（如圖）。但是，天然真核細胞表達系統(tǒng)糖表位修飾N-糖基化重組蛋白的均質(zhì)性很低，這種異質(zhì)性源于哺乳動物復(fù)合型N-多糖合成的多步驟過程。

Schematic diagram of antibody glycosylation modification in eukaryotic cells

普健生物擁有十余年的蛋白表達經(jīng)驗，經(jīng)過不斷的探索和改進，開發(fā)了建立了3H（High through、High efficiency、High quality）大腸桿菌表達系統(tǒng)，擁有獨特的表達純化及復(fù)性平臺，95%以上的超高蛋白表達成功率，已成功交付上萬例大腸桿菌表達服務(wù)項目。如果您有大腸桿菌重組蛋白表達與純化項目需求，歡迎聯(lián)系027-87001869與我們的專員進行溝通！

Schematic diagram of the production of N-glycosylated recombinant proteins using Escherichia coli

A: Ｒecombinant protein pathway modified by N-glycosylation in Escherichia coli; B: Cell-free glycoprotein synthesis pathway

O-糖基化修飾可以增加治療性蛋白的穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)時間。雖然糖基化修飾對每種蛋白質(zhì)的影響可能不同，但研究顯示N-糖基化修飾可通過以下方式改善蛋白的理化性質(zhì):

①通過屏蔽非結(jié)構(gòu)化、疏水性或易于蛋白酶作用的蛋白質(zhì)區(qū)域來防止變性、聚集和降解；

②增加分子的分子量和流體動力學(xué)半徑以減少腎濾過；

③去除免疫原性，減少免疫系統(tǒng)清除；

④覆蓋或去除可被人凝集素識別/清除的末端結(jié)構(gòu)。

目前，利用大腸埃希菌解決了均質(zhì)性修飾N-糖基化修飾重組蛋白問題。該技術(shù)有望首先在糖疫苗生產(chǎn)方面得到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

參考文獻

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